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丙酮酸是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵中間產(chǎn)物,在肌肉中會(huì)轉(zhuǎn)化為乳酸,或通過(guò)三羧酸循環(huán),參與到細(xì)胞的能量代謝。是許多生物合成途徑的前體,可轉(zhuǎn)化為氨基酸,脂肪酸和糖原等。當(dāng)出現(xiàn)饑餓的時(shí)候,丙酮酸會(huì)起到調(diào)節(jié)作用,幫助維持血液酸堿平衡。丙酮酸具有一定的抗氧化作用,減少自由基的產(chǎn)生,保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響。在細(xì)胞內(nèi),丙酮酸可以作為信號(hào)分子,通過(guò)影響酶的活性,參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡等過(guò)程。丙酮酸還參與脂肪酸的合成和分解,維持脂肪的代謝平衡。大蒜中丙酮酸的含量比較高。
丙酮酸有3個(gè)碳,屬于三碳酸類化合物,具有特殊的果香氣息?;瘜W(xué)結(jié)構(gòu)為CH3COCOOH,包含1個(gè)酮基(C=O)和1個(gè)羧基(COOH),具有強(qiáng)烈的酸性,能和堿反應(yīng)生成丙酮酸鹽。溶于水、氯仿和甲醇,但不溶于 二乙醚。通過(guò)醛縮反應(yīng)轉(zhuǎn)化為 丙酮 和 碳酸酯,在還原劑的作用下被還原為丙醇 ,并且在加熱條件下能夠脫水生成丙烯酸。
測(cè)定生物組織中丙酮酸含量的方法,常用到高效液相色譜(HPLC)。
1.樣品處理
稱取樣品4g,放入15min離心管中,加入5ml的水,4℃超聲30min,4℃冰箱靜置2h,取出4000r/min離心10min,定容10ml后0.45um膜過(guò)濾待測(cè)。
2.色譜條件
C18色譜柱,250*4.6mm,5μm,柱溫30℃;紫外檢測(cè)器或VWD,波長(zhǎng)210nm;流速1ml/min,10-20uL。0.1%磷酸水:甲醇=97.5:2.5為流動(dòng)相,等度洗脫,或采用乙腈-磷酸二氫鉀(梯度洗脫)。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線
確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候,需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶解并進(jìn)行成倍的稀釋,大約5-7個(gè)點(diǎn),一般用6個(gè)濃度。要進(jìn)行脫氣處理,進(jìn)樣的HPLC測(cè)出各個(gè)濃度的色譜峰,記錄保留時(shí)間,對(duì)色譜峰面積積分,對(duì)應(yīng)這個(gè)峰的濃度,擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程,相關(guān)系數(shù)需要1>R2>0.999。
4.含量計(jì)算
將樣品溶液按對(duì)應(yīng)的體積要求,可以手動(dòng)進(jìn)樣,也可以自動(dòng)進(jìn)樣。根據(jù)保留時(shí)間,確定出樣本的目標(biāo)色譜峰,對(duì)這個(gè)色譜峰面積進(jìn)行積分,代入到回歸方程,可以計(jì)算出樣本溶液中的丙酮酸含量。