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蘇氨酸是人體必需氨基酸之一,必需靠外在的食物獲得,它主要參與蛋白質(zhì)的合成,脂質(zhì)代謝,調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝和腸道功能,穩(wěn)定情緒變化和促進(jìn)肌肉生長。蘇氨酸主要來源于植物的谷物,蘑菇,綠色蔬菜,花生,胡蘿卜等,以及動(dòng)物的肝臟,肉類,蛋類,乳制品等。蘇氨酸的化學(xué)式為C4H9NO3,分子量為119.12,具有旋光性,易溶于水,微溶于乙醇,不溶于乙醚。蘇氨酸的代謝途徑主要分為三條:1.通過醛縮酶催化代謝為甘氨酸和乙醛;2.通過蘇氨酸脫酶(TDG)代謝為氨基丙酸、甘氨酸、乙酰COA;3.通過蘇氨酸脫水酶(TDH)代謝為丙酸和α-氨基丁酸。
檢測樣品中蘇氨酸的方法,實(shí)驗(yàn)室常用到高效液相色譜(HPLC)。
1.樣品處理
先稱取0.1g,倒入到15ml離心管中,再加入1ml的6mol/L的HCl,蓋上蓋子,在振蕩器上充分混勻5min,放入105℃的烘箱中水解24h。等完成后,拿出來用冷水冷卻到室溫狀態(tài),看看里面的液體有沒有損失,如果有損失就用上面的HCl來補(bǔ)充。后面,就加入1ml的6mol/L的NaOH溶液,繼續(xù)振蕩混勻5min。放到4000r/min離心10min,取上清液準(zhǔn)備進(jìn)行衍生化處理。
取0.5ml上面得到的上清液,放到15ml棕色的離心管中,加入pH=9.0 碳酸氫鈉緩沖溶液和DNFB各0.5ml,放入60±0.5℃水浴中,避光反應(yīng)60min。用冷水冷卻至室溫,加入3.5ml pH=7.0磷酸緩沖溶液,充分混勻,室溫避光反應(yīng)15min,取上清液過0.22μm 濾膜待測。
2.色譜條件
C18色譜柱:250*4.6mm;5μm,柱溫:38℃。紫外檢測器,波長360nm;流動(dòng)相:A:乙腈:甲醇=90:10 B:0.02mol/L磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉,梯度洗脫;流速1ml/min,進(jìn)樣量10uL。僅供參考。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線
將蘇氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解和稀釋。成倍的稀釋,比如2mg/L,5mg/L,10mg/L,20mg/L,50mg/L,100mg/L。進(jìn)樣到HPLC測出對應(yīng)的色譜峰,記錄色譜峰的保留時(shí)間,對色譜峰面積進(jìn)行積分,對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程,相關(guān)系數(shù)R2要大于0.999并接近于1。
4.含量計(jì)算
將樣品進(jìn)樣到HPLC,識(shí)別出目標(biāo)化合物的色譜峰,對峰面積進(jìn)行積分,并代入到回歸方程,計(jì)算出樣品中的蘇氨酸含量。